如何收集与制备气管/支气管肺泡灌洗液样本
1.样本的采集
（呼吸道组织学解剖图，来自Cianetal,）正确采集呼吸道灌洗液，首先要了解呼吸道的构造，以及不同解剖部位对应的不同特征细胞。气管与主支气管由伪分层纤毛上皮细胞（pseudostratified,ciliatedepithelium）覆盖（见上图A），因此气管冲洗液中我们经常会见到大量这种细胞，伴随着少量具有分泌作用的杯状细胞。下呼吸道的小支气管与细支气管上则覆盖着有纤毛或无纤毛的立方上皮细胞（见上图B），这类细胞在气管冲洗液（TW）与支气管肺泡灌洗液（BAL）中都会出现。下级支气管继续延伸过度至肺泡，则会出现覆盖90%肺泡表面的扁平的1型肺细胞与合成表面活性剂的少量立方柱状的2型肺细胞（见上图C），此外还有肺泡巨噬细胞，也是健康动物支气管肺泡灌洗液（BAL）里的常见细胞。肺泡组织学结构有两种方法可以采集呼吸道灌洗液：气管穿刺灌洗法（Transtrachealsampling）与呼吸道插管灌洗法（Endotrachealtubesampling）。气管穿刺相当方便，仅需皮下注射利多卡因进行局部麻醉，不经过口腔，避免了口腔喉部的污染。穿刺点位于咽喉下方两节气管软骨之间（C2-C3，C3-C4；笔者注：最理想位置为甲状软骨与环状软骨之间的环甲韧带），需要对动物进行局部剃毛与无菌消*，并保持其处于脖子伸展的坐姿保定状态。当专用穿刺套件中的导管到达气管隆脊上方即可撤回留置针针头，仅留导管在气管内，并使用无菌生理盐水（1-2ml/kg）冲洗即可获得气管冲洗液。插管灌洗法则需要将动物置于全麻状态下，使用气管导管盲插或在内窥镜辅助下使用生理盐水（2-5ml/kg）进行灌洗。将动物置于侧卧位或胸卧位，注意在灌洗或是内窥镜插入气管导管时都要尽量避免口腔污染。这种方法既可用于采集气管冲洗液，也可用于采集支气管肺泡灌洗液，但如果对采样部位有特定要求，则需熟悉解剖位置，根据采样前的影像定位，使导管进入相应的支气管分叉。（笔者补充：使用哪种方法取决于麻醉条件及动物配合度，但最重要的是在临床症状、听诊与影像中预判病灶是否累及肺泡，如果仅为上呼吸道感染，插管灌洗则是没有必要且弊大于利的，不仅操作复杂、成本高、主人接受度差，而且更容易被口腔污染。注意：灌洗前要先排除心源性呼吸困难和气管异物堵塞。）一般我们用EDTA管保存用于制作细胞涂片的灌洗液，以免带血样本细胞凝聚；用空白管保存用于微生物培养的样本。采样后立即涂片染色，如果灌洗液看上去很清澈，可能需要额外离心浓缩（取-ul样本，-rpm，5min）。尽量在采样后1小时内完成制片，以免细胞裂解。计数可能需要用到专用细胞计数仪Cytospin。如果样本中有悬浊成分（下图左），可用吸管捕捉后压片染色观察（下图右），多为黏液丝，可卷带重要细胞与病原体在内。呼吸道灌洗液的实验室检查
呼吸道灌洗液检查包括以下内容：物理性质：正常的气管冲洗液（Trachealwashes，简称TW）和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavages，简称BAL）外观应为清澈透明（如下图左边的样本），BAL还会带有浮沫（肺泡的表面活性剂所致，如下图中间的样本）。液体浑浊、粘稠都代表着细胞增加，红色丝状物是出血的指征（如下图右边的样本）。全细胞计数与有核细胞分类：由于灌注方法与灌注液体积不同，外加粘液凝聚干扰，往往难以对细胞总计数进行标准化比较。因此有核细胞的分类与比例更具有诊断意义。数-个细胞，并记下每种白细胞的数量，同时用半定量（无、少量、中等量、大量）记录上皮细胞。微生物培养或PCR检测病原体：即使细胞学涂片上未发现病原体，也不代表病原体不存在。PCR检测比微生物检测更敏感，也更快捷，但我们需要根据临床预先判断需鉴定的病原体类型。有些病原体，例如怀疑寄生虫感染，还可以考虑使用血液检测抗原或抗体，或是通过在粪便里寻找虫卵的方式来证明。（笔者补充：注意如呼吸道灌洗液中含有大量中性粒细胞，细菌可能会在运输或初步培养过程中死亡，导致微生物培养呈假阴性结果，因此应养成将新鲜样本立即涂片染色的习惯，这对找出细菌存在证据的意义很大。）呼吸道灌洗液细胞学
呼吸道灌洗液常见有形成分与细胞类型柱状与立方体形上皮细胞：这种细胞覆盖着从气管到终端支气管的整个呼吸道，可带有纤毛（纤毛也可能在制片过程中脱落散布到背景中），在镜检中游离或成簇出现。TW中常见大量，BAL中可见少量，一般不纳入分类计数范围。钟状细胞：这是一种分泌黏液的上皮细胞，呈柱状，细胞内含红色或蓝色的颗粒，制片时可能散落到胞外。肺泡巨噬细胞：BAL样本中最常见的细胞，为含空泡的大型单核细胞，细胞核偏心，形状从圆形到豆子型不等，胞浆丰富且呈淡嗜碱性。当巨噬细胞被激活时，可以观察到胞浆内空泡与泡沫增加，甚至可见吞噬相。小淋巴细胞：来自外周循环，为细胞核-胞浆比较高的小圆细胞，轮状的胞浆呈嗜碱性，细胞核圆且色深，富含染色质，核仁模糊不清。健康犬TW/BAL样本中可达到14%白细胞占比。中性粒细胞：来自外周循环，健康动物TW/BAL中含量极低，只有在炎症尤其是发生感染时会上升，并可能出现退化。嗜酸性粒细胞：来自外周血，胞浆内含粉橙色颗粒，健康动物TW/BAL中几乎不可见，但在一些健康猫的TW/BAL中可能达到25%白细胞占比。肥大细胞：胞浆内含大量紫色/品红色颗粒，也可脱落至背景中，细胞核圆且偏心，健康动物TW/BAL中几乎不可见。鳞状上皮细胞：为带有较小细胞核的大型多边形上皮细胞，在TW/BAL中为口腔采样污染的指示物，常会沾染口腔常驻菌（例如下图呈钱串状堆聚的Simonsiellasp.，又称Conchiformibius）。出现这种细胞，常意味着需要重新采样。（注意：要么立即重新采样，要么48小时后再采样，因为插管会刺激呼吸道吸引中性细胞短暂聚集，造成假阳性结果。）红细胞：常见于呼吸道急性出血或采样时的血液污染。黏液丝：为蓝色或粉色的无定型体，可含颗粒。来自小支气管的黏液可能出现下图这种螺旋管形，被称为Curschmannspiral。有炎症时黏液可能会变多。其他有形成分：感染病原体（细菌、真菌、原虫）、污染物（淀粉、花粉、植物成分）或其他物质（如吸入的硫酸钡粉）。气管冲洗液与支气管肺泡灌洗液的细胞学常见发现无诊断意义样本：有核细胞未发现或数量太少，一般是采样问题导致。口腔咽喉污染，样本中出现鳞状上皮细胞并伴随Simosiella及其他细菌，口腔白细胞也可能出现在污染中。BAL样本中出现大量带纤毛的柱状上皮细胞，说明灌洗未到达支气管肺泡位置，样本是一个气管冲洗液。正常样本：关于各类白细胞在犬猫TW/BAL里的数量参考范围目前学术界还未有统一标准，但我们可以数-个有核细胞，并针对白细胞参考下面表格里的分类定量指标，来判断是否属于正常范围（Raskinetal.）：BAL样本犬猫有核细胞总计数cc/uLcc/uL巨噬细胞70-80%70-80%淋巴细胞6-14%5%嗜酸性粒细胞5%25%中性粒细胞5%6%肥大细胞2%2%超敏反应：可由过敏性支气管炎/肺炎、猫哮喘、肺线虫、心丝虫、真菌感染、嗜酸性粒细胞性支气管炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性支气管肺炎（犬）等病因引起，常伴随着嗜酸性粒细胞的相对与绝对数量同时上升。见上表中，健康（或亚临床超敏）猫可能也会出现相对较高的嗜酸性粒细胞增加。如怀疑寄生虫类疾病，需在10倍镜下寻找蚴虫或虫卵，并配合血清抗原/抗体、粪便贝尔曼或粪便硫酸锌悬浮法等方法检测寄生虫。需要注意的是，呼吸道寄生虫或真菌感染不一定总是引起嗜酸性粒细胞增加，也可能出现中性粒细胞增加。（犬肺线虫感染，无嗜酸性性粒细胞细胞增多）炎症：常伴随中性粒细胞绝对与相对数量的上升。健康动物样本中中性粒细胞的数量非常少，一般小于5-6%，但也偶见无炎症时增加至20%的情况，需结合临床判断，还要排除是否是口腔与血液污染导致。慢性炎症中常见含泡沫的巨噬细胞增多，且黏液与钟形细胞数量也会上升。炎症分为感染性与非感染性，在感染性炎症中，常可见因为细菌*素导致的中性粒细胞退行性变化以及白细胞吞噬相。非感染性炎症的病因可能是*素（烟雾、氨气）或肿瘤等造成的呼吸道刺激与坏死。分辨感染性炎症时还要特别留意病原体类型，因为呼吸道有很多常驻细菌（多为革兰氏阴性菌），在炎症感染时数量也会增加，但并不是疾病的根源。常见的呼吸道致病病原体如下：细菌类：分枝杆菌（结核）博氏杆菌支原体真菌类：隐球菌曲霉菌肺孢子菌（肺囊虫）Blastomyces,Coccidioides,andHistoplasma.寄生虫类：血管圆线虫（犬）猫圆线虫（Aelurostrongylusabstrusus）Oslerusosleri(dog),Filiaroideshirthi(dog),Crenosomavulpis(dog),Eucoleus(Capillaria)aerophila(dog,cat)andToxoplasmagondii(cat).病*感染很难在细胞学中体现，因为灌洗样本往往并不具备特异性的淋巴细胞增多现象，而继发细菌感染非常常见，导致病*性呼吸道感染最终细胞学表现与细菌性感染雷同。常见呼吸道病原体细胞学形态（笔者补充：绝大多数呼吸道感染都伴随中性粒细胞上升，有时候即使没有看到病菌，但出现大量中性粒细胞，也应排查病原体感染；如果中性粒细胞伴随退化性变化与吞噬相，则极有可能为细菌感染。如果仅看到细菌却未见中性粒细胞，或中性粒细胞较少且无退化相，则要考虑存在污染的可能，微生物培养时也要更注意致病菌菌种鉴定，以及鉴定出的菌种是否符合临床表现。当然，偶尔存在微生物感染并未伴随中性粒细胞上升，有时中性粒细胞来自出血部位的外周血，这些特殊情况需要具体区分。）出血：采样出血与急性出血都会导致样本中出现红细胞，但如果发现退化的红细胞（血铁*素、血红素）则意味着为陈旧性出血的积液/分泌物，常见原因为呼吸道血管损伤或红细胞渗出，也可由呼吸道寄生虫机械性损伤导致。（注：呼吸道出血较常见于犬，猫罕见。）慢性出血的常规染色（左）与普鲁士蓝（右）染色，后者能更好地鉴别血铁*素肿瘤：原发性肺部肿瘤：常为单发性肿瘤，累及支气管树，因此常可在BAL样本中被发现。多为癌症（恶性上皮肿瘤），需组织病理学进一步确诊。肿瘤细胞常聚集成簇，有非典型恶性征，如看见腺样形态则可能是腺癌。（犬原发性肺癌）继发扩散性肺部肿瘤：常为多发性病灶，肿瘤细胞定植于间质，不常累及支气管树，因此不太容易脱落出现在灌洗样本中。多为淋巴瘤、癌、组织肉瘤转移。这种情况下更适合在影像引导下直接对肿块进行穿刺采样，但需预计到存在采样导致的医源性扩散风险。（犬祖细胞肉瘤肺转移）笔者评语：呼吸道疾病在动物临床上相当常见，即使是成年动物，也经常罹患呼吸道感染，其治疗过程往往漫长。如不加注意，还可能发展为肺炎，危及生命，且治愈不当容易复发。但同时，很多呼吸道症状并非感染引发，例如过敏（哮喘）、异物、肿瘤……盲目当作呼吸道感染治疗，既延误病情，还会造成抗生素滥用。因此明确病因是治疗呼吸道疾病的关键。临床上多数呼吸道疾病通过口鼻拭子PCR检测与X光影像即可确诊，但当出现未能证明病原体存在、药物治疗无效、病程慢性反复等情况时，我们就要考虑进行呼吸道灌洗检查了。事实上，我们建议出现肺炎且连续使用3-5天抗生素后未见改善，就应立即进行支气管肺泡灌洗，以找到最合适的抗生素，保证5-7周的完整用药疗程可以完全杀灭致病菌同时避免产生耐药菌株和疾病复发。正确的灌洗液检查可以区分炎性与非炎性疾病，可以探查出深部的病原体（口鼻拭子或鼻腔灌洗均无法达到该部位），甚至可以诊断原发性肿瘤，在没有内窥镜或CT辅助下亦可操作与诊断，整个过程不超过15分钟（气管冲洗）/30分钟（支气管肺泡灌洗），是与细针抽吸、骨髓穿刺同样简单又高效的门诊检查。但由于体液细胞学的普及度较低，很多临床医生认为对呼吸道疑似微生物感染仅需鼻腔口腔拭子或鼻腔灌洗液进行培养即可确诊，这是一大常见误区！现有文献研究均表明，对患有细菌与真菌呼吸道感染的犬猫进行鼻腔采样，病原体检出率极低，而鼻腔口腔中大量常驻菌又会极大干扰培养结果，获得一堆没有临床意义的菌种鉴定结果；另一大误区是，很多医生对操作不熟悉，认为灌洗必须通过内窥镜，或者必须全麻，事实并非如此。临床应掌握最简单的局麻气管冲洗，这种方式在动物配合且没有肺炎症状的情况下最为适合，因为临床上口腔进入的呼吸道灌洗污染率非常之高（有统计表明兽医临床上20%-40%的内窥镜带有口腔污染），如果没有微生物专家的帮助，经常会给诊断带来不必要的干扰。对于患有弥散性肺炎的动物，需计算好导管的长度，通过呼吸道插管后进行盲灌，同样可以获取合适的样本（仅需注意灌洗液抽出时是否是带表面活性剂的泡沫就能知道是否到达了正确的位置）。这些操作风险很低，极偶尔会产生皮下气肿或中隔气肿，残留未回收的生理盐水也能被肺很快地吸收，最常见的副作用是气管灌洗时颈部剃毛造成的皮肤红疹。只有局部病变，或疑似曲霉菌感染（这种霉菌吸附力极强，很难脱落于灌洗液中），以及疑似间质性病变时，必须要内窥镜的辅助来精确定位并观察，必要时可配合活检或细胞学刷采样。如同所有的体液一样，灌洗液取出后需要立即装入含EDTA抗凝剂的容器中，并制作细胞学涂片，根据细胞类型尤其是有核细胞的百分比预判疾病大类与病程状态。不经涂片的病原体检测，容易遗漏重要的临床信息。鉴于呼吸道感染经常是一种以上病原体混合感染（病*+支原体+博德氏菌/继发兼性致病细菌，临床上混合感染比例高达50%），因此进行病原体检测时我们推荐做核酸检测来查找所有可能的常见病原体，并配合微生物检测确定合适的抗生素。细胞学诊断远不及微生物培养与PCR敏感，但能提供很好的方向，并且在出现混淆情况（如假阴性）时经常能给予辅助判断；但在过敏性疾病中，呼吸道灌洗液细胞学是确诊必不可缺的诊断之一，只有细胞学下的特征符合，临床影像符合，且PCR病原体检测为阴性时，才能确诊为过敏性哮喘，给予长期激素治疗。思考问题下方左右两图分别为两例犬支气管肺泡灌洗样本。
a)请问图片中都出现了哪些细胞？
b)是否能根据画面中的细胞区分炎性与非炎性、感染性与非感染性？
c)左右两张图片中你是否能发现并推测病原体种类？
课程相关信息：本课程系列由兽医病理学专家Dr.FrancescoCian（意大利）以线上课程的方式在VETcpd平台上主讲，并由科宝智慧医疗动物事业部整理为中文学习笔记，供广大临床兽医师参考。Dr.Cian是英国BattLab动物第三方临床检测实验室（隶属于德国纳博科临实验室）的主管与细胞学专家，并曾在年来华进行细胞学培训巡讲，著作有《兽医细胞学》并被翻译为各种语言版本。本笔记仅记录课程精华内容与笔者个人体会，完整内容请见完整课程（vetcpd.co.uk/product/fluid-cytology-for-general-practice-od）。笔记整理者：梁佳莹DVM
德国莱比锡大学动物医学学院毕业，德国执照兽医师，寄生虫学与神经科学在职博士；
曾就职于德国纳博科临实验室担任中国市场与技术总监，擅长临床检测；目前就职于德国科宝国际有限公司总经理，科宝全球动物事业部负责人。
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