关键词婴幼儿；高危；哮喘；肺功能；嗜酸性粒细胞；Creola小体；呼气一氧化氮
喘息是婴幼儿期常见的呼吸道症状，其高发病率、高增长率已成为一个重要的公共健康问题。流行病学资料显示70％的支气管哮喘（哮喘）患儿喘息首发于婴幼儿期，约2／3在6岁前消失，余l／3反复发作并进展为哮喘［1］。潮气呼吸肺功能在婴幼儿平静呼吸时即能检测呼吸道功能，对诊断和评估婴幼儿喘息疾病具有较大的潜能［2］。有研究显示Creola小体，即脱落的上皮细胞簇，可用于识别婴儿哮喘的进展［3-4］。近几年，痰嗜酸性粒细胞（EOS）计数及呼气一氧化氮（FeNO）作为哮喘呼吸道炎性指标被广泛应用于临床［5］。本研究对哮喘高危婴幼儿喘息发作时的肺功能和EOS、Creola小体、FeNO等炎性指标进行相关研究，以探讨其在哮喘中的诊断价值。1资料与方法1.1 研究对象 选择年4月至年8月因喘息性支气管炎和喘息性支气管肺炎入住医院呼吸科的例哮喘高危婴幼儿为观察组。其中男78例,女57例，男女比为1.37∶1.00;中位年龄为12个月（7～21个月）。入选标准：≤3岁，病程≤7d，肺部听诊闻及哮鸣音，为第2次喘息发作或第1次喘息发作且需具备以下任一条件:（1）有哮喘一级亲属家族史；（2）医师明确诊断的变应性鼻炎、湿疹、食物过敏；（3）既往外周血EOS增多(＞4%)；（4）既往变应原检测提示吸入性或食物变应原致敏Ⅱ级以上。排除标准：先天性呼吸道畸形、肺部发育不良等呼吸系统疾病,肺部影像学存在间质性肺疾病或重症肺炎,其他各种非呼吸道疾病引起的喘息，伴心、肝、肾、血液等系统及代谢性疾病等。选取同期医院门诊心脏超声科筛查和随访的非喘息、非过敏、无心脏及其他系统疾病的健康儿童例作为健康对照组。其中男例,女95例，男女比为1.11∶1.00;中位年龄为12.00个月（6.25～24.00个月）。观察组和健康对照组性别和年龄差异均无统计学意义（均P0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审批通过（批准文号：LW），同时征得患儿监护人同意，并签署知情同意书。1.2 方法 1.2.1 潮气呼吸肺功能测定及支气管舒张试验(BDT) 入院后即使用德国JAEGER肺功能仪测定潮气呼吸肺功能及BDT。婴儿取仰卧位，颈部略伸展，保持上呼吸道通畅,选择合适的面罩。选用g/L水合氯醛0.5mL/kg口服或肛门灌肠镇静（不超过10mL）。熟睡呼吸平稳后，每15~20个呼吸环记录1次，连续记录至少5次测试，仪器自动取其平均值作为最终结果。而后给予支气管舒张剂(硫酸沙丁胺醇0.5mL+9g/L盐水1.5mL)雾化吸入，15min后再次进行潮气肺功能检查，BDT成功率为%。主要测定参数：每公斤体质量潮气量（VT/kg）、达峰时间比(TPTEF/Te)、达峰容积比(VPTEF/Ve)、呼吸频率（RR）、吸呼比（Ti/Te）、剩余50%潮气量时的呼气流速（TEF50%-r）、剩余25%潮气量时的呼气流速（TEF25%-r）、剩余25%潮气量呼气流速与峰值流速之比（25/PF）。肺功能病情分级依据［6］：28%≤TPTEF/Te≤55%为正常，23%≤TPTEF/Te＜28%为轻度阻塞，15%≤TPTEF/Te23%为中度阻塞，TPTEF/Te15%为重度阻塞。1.2.2 痰液标本采集 入院24h内使用无菌负压吸痰法采集患儿鼻咽部分泌物。清理鼻腔，将吸痰软管经鼻腔插入7cm左右达到咽部以下，吸取鼻咽部分泌物2mL移入到加入无菌9g/L盐水的试管中，振荡混匀。合格标本的判断标准：白细胞﹥25个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞﹤10个/低倍镜视野。1.2.3 甲型流感（Flu-A）、呼吸道合胞病*（RSV）、腺病*(ADV)、副流感病*(PinF)、人鼻病*（HRV）、人偏肺病*（hMPV）、博卡病*（hBoV）检测 （1）DNA和RNA的提取：4倍体积的9g/L盐水加入上述采集的鼻咽分泌物试管中，室温条件下×g离心5min，上清吸入新的样品管中；采用德国Qiagen公司的QIAampMinEluteVirusSpinKit核酸提取试剂盒提取核酸，使用QIAampMinElute色谱柱膜，在标准微型离心机或全自动QIAcubeTM上进行，得到纯化的病*核酸。（2）核酸扩增（PCR-荧光探针法）：应用实时荧光PCR检测Flu-A、RSV、ADV、PinF、HRV、hMPV、hBoV。1.2.4 血EOS、痰EOS及Creola小体检测 入院后采集患儿外周静脉血进行血EOS测定；采集完痰液后，每份痰液标本均同时涂2张玻片，mL/L乙醇固定后进行HE染色，涂片中存在巨噬细胞及纤毛柱状上皮细胞，表明痰液来自下呼吸道，符合质量控制。依据涂片编号报告结果（盲法），查找EOS，进行定性分析，同时选取最大的Creola小体计数其所含的柱状上皮数量，评分如下：细胞数10~个，计1分；细胞数~个，计2分；细胞数~个，计3分；细胞数~0个，计4分；细胞数≥0个，计5分［7］。1.2.5 FeNO测定 婴幼儿镇静睡熟后，即采用瑞士艾科潮气呼吸分析仪进行光化学法测定，检查前2h内无剧烈运动，禁食富含氮的食物(如香肠、动物内脏、莴苣和菠菜等)，禁喝含咖啡因的饮料，应在肺功能测定前进行。1.3 统计学处理 数据采用SPSS21.0软件进行统计分析。计数资料以百分比表示,组间比较采用Fisher′s确切概率法；正态分布计量资料以x?±s表示，组间比较采用t检验或方差分析；非正态分布以中位数（M）、四分位数间距（IQR）表示,组间比较采用秩和检验；采用Kappa进行一致性分析，Spearman进行相关性分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 观察组和健康对照组潮气呼吸肺功能参数的变化 观察组RR高于健康对照组，差异有统计学意义（P0.05）；观察组VT/kg、25/PF、TPTEF/Te、VPEF/Ve均显著低于健康对照组，差异均有统计学意义(均P0.05），见表1。2.2 观察组BDT阳性率比较 观察组中45例患儿BDT后TPTEF／Te和VPTEF／Ve［17.60%（10.00%）、21.60%（7.50%）］显著低于BDT前［22.20%（8.10%）、25.20%（6.20%）］，差异均有统计学意义（Z=-3.45、-2.78，均P0.05）；余90例患儿中46例BDT阳性，阳性率为51.11%。进一步分析发现，肺功能轻度阻塞组BDT阳性率为20.00%（3/15例），中度阻塞组为26.56%（17/64例），重度阻塞组为48.72%（19/39例）。随病情加重，BDT阳性率逐渐增高，不同程度阻塞组比较差异有统计学意义（F=6.，P0.05）。2.3 TPTEF/TeBDT阳性与其他肺功能参数一致性分析 VPEF/Ve、25/PF与TPTEF/TeBDT阳性一致性较好，有统计学意义（Kappa=0.78、0.49，均P0.）。TEF50%-r、TEF25%-r与TPTEF/TeBDT阳性一致性较差（均P0.）。2.4 婴幼儿FeNO变化 观察组FeNO［3.80（5.43）μg/L］显著低于健康对照组［9.60（11.3）μg/L］,差异有统计学意义（Z=14.56，P0.05）。RSV、HRV、PinF、Flu-A、ADV、hMPV、病*混合感染患儿FeNO分别为3.55（6.47）μg/L、3.80（4.45）μg/L、5.70（9.45）μg/L、4.80（3.40）μg/L、3.60(5.12)μg/L、3.50(4.87)μg/L、3.30（1.00）μg/L，均低于健康对照组，hBoV感染患儿FeNO［13.40（15.90）μg/L］，高于健康对照组，差异有统计学意义（Z=13.21，P0.05）。2.5 不同喘息次数肺功能和炎性指标的比较 第2次喘息组RR、Ti/Te、TPTEF/Te、VPEF/Ve、25/PF均低于第1次喘息组，但差异无统计学意义（均P0.05）；第2次喘息组TEF50%-r、TEF25%-r均高于第1次喘息组，差异均有统计学意义（t=3.34、2.77，均P0.05）。痰EOS、FeNO、Creola小体评分在第1次喘息和第2次喘息患儿间差异均无统计学意义（均P0.05），见表2。2.6 肺功能参数、炎性指标相关性分析 Spearman相关性分析显示，25/PF与TPTEF/Te、VPEF/Ve呈正相关（r=0.78、0.60，均P0.）；痰EOS与血EOS、Creola小体呈正相关（r=0.20、0.21，均P0.05），与FeNO无相关性（P0.05）；潮气呼吸肺功能RR、VT/kg、Ti/Te、TPTEF/Te、VPEF/Ve、TEF50%-r、TEF25%-r、25/PF等与EOS、Creola小体、FeNO等无相关性（均P0.05）。3讨论婴幼儿喘息性疾病和反复喘息是儿科临床常见的现象，如何早期将哮喘婴幼儿甄别出来进行早期干预是临床医师面临的紧迫而富有挑战性的任务。一方面需要搜集患儿临床情况并进行分析，另一方面需要借助各种检测技术。然而目前多数检测技术适用于年长儿童或成人,但不适合婴幼儿，不利于婴幼儿哮喘早期诊断。潮气呼吸肺功能在婴幼儿安静呼吸时即可测定潮气容量曲线及相应呼吸参数的变化。TPTEF／Te、VPTEF／Ve是评价婴幼儿潮气肺功能的主要指标［8-9］,反映小呼吸道阻塞情况。本研究观察组TPTEF/Te、VPEF/Ve均明显低于健康对照组，表明喘息发作期肺功能损害以小呼吸道为主，阻塞越严重，此比值越低［10］。观察组患儿RR较健康对照组升高，VT/kg、25/PF较健康对照组下降；第2次喘息患儿TEF50%-r、TEF25%-r高于第1次喘息患儿，反复喘息患儿呼吸道阻塞程度增加，以上肺功能指标的变化在一定程度上反映呼吸道功能损伤，可作为判断病情变化的敏感指标。BDT评估气流受限的可逆性，是确诊哮喘的主要手段。本研究发现大部分患儿BDT后TPTEF／Te和VPTEF／Ve反而较前明显下降，与任妍等［11］的研究一致。目前原因尚不完全清楚，可能是年龄越小的儿童，呼吸道平滑肌越不发达，β2受体数量越少或功能越差，呼吸道对药物不能产生完整的反应；其次，年龄越小儿童喘息急性发作时主要是黏液分泌增多，而非平滑肌痉挛。本研究以TPTEF/Te改善率≥15%作为BDT阳性的判定标准［12］,进行Kappa一致性分析发现，VPEF/Ve、25/PF与TPTEF/TeBDT阳性一致性较好。有文献报道，25/PF常说明小呼吸道病变，其变化与临床病情的轻重和转归有明显相关性［13］；本研究发现25/PF与TPTEF/Te、VPEF/Ve呈正相关，与TPTEF/Te、VPEF/Ve意义一致，可用于评判气流阻塞的可逆程度，在喘息发作急性期均明显下降。本研究发现阻塞程度越重，BDT阳性诊断价值越高［14］。文献表明，FeNO可作为反映EOS性呼吸道炎症的标志物［15］，并被国内外许多指南和共识广泛推荐用来协助哮喘的诊断、病情的评估、预测激素治疗的反应性等。但本研究发现FeNO在婴幼儿喘息发作组明显低于健康儿童。另有研究报道也显示RSV感染的毛细支气管炎幼儿急性期FeNO低于正常值，但随访观察发现，部分未康复患儿复查的FeNO水平上升，超过正常值，出现“反弹现象”［16］。分析原因，可能因喘息发作时支气管痉挛、气流受限，下呼吸道产生的一氧化氮不能呼出体外所致。有学者指出，RSV感染急性期并非为嗜酸性粒细胞性呼吸道炎症［16］，病*诱发的喘息主要与中性粒细胞性呼吸道炎症密切相关［17］，所以会导致FeNO暂时性下降。本研究中纳入的RSV、HRV、Flu-A、PinF、ADV、hMPV甚至混合病*检测阳性的所谓哮喘高危喘息儿也许是病*诱发的短暂喘息，并非真正的哮喘患儿，并非为EOS性呼吸道炎症表现。全球哮喘防治创议（GINA）指出，对于上呼吸道感染反复咳嗽喘息的学龄前儿童，FeNO持续升高4周以上，可用来预测哮喘的发生［18］。因此，持续动态监测FeNO变化在儿童哮喘早期预测中有一定价值。本研究中hBoV感染后FeNO较健康对照组升高，Huang等［19］发现hBoV感染引起支气管上皮细胞发生病变效应，导致诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生增加，从而FeNO水平升高，但其致病机制尚待进一步研究。近年来，关于FeNO水平与肺功能相关性的研究非常多，但研究结果不尽相同。国外有报道称FeNO与肺功能无关［20］。亦有报道指出，儿童喘息性疾病实质为呼吸道炎症，而患儿的临床表现、肺功能指标及呼吸道炎症三者经研究分析后并无明显相关性［21］。本研究采用Spearman分析，潮气呼吸肺功能RR、VT/kg、Ti/Te、TPTEF/Te、VPEF/Ve、TEF50%-r、TEF25%-r、25/PF等参数与EOS、Creola小体、FeNO等炎性指标无相关性，其临床应用价值尚需进一步探讨。哮喘是慢性呼吸道炎症性疾病，EOS是其主要的效应细胞，GINA明确指出，痰或血中EOS增多是哮喘急性发作的独立风险因素和发展为固定气流受限的风险因素［18］。Yamada等［3］报道约65%的喘息婴幼儿的痰液中发现了Creola小体，可预测哮喘发生、评估呼吸道高反应性。本研究采用Spearman相关性分析，痰EOS与血EOS、Creola小体呈正相关，提示检测Creola小体对预测哮喘可能有所帮助。综上，婴幼儿喘息发作急性期肺功能呈不同程度阻塞性通气功能障碍，阻塞程度越重，BDT阳性诊断价值越高；单次FeNO测定价值有限，持续动态监测对预测哮喘的发生可能意义更大；痰EOS与血EOS、Creola小体呈正相关，检测Creola小体对预测哮喘可能有所帮助；肺功能与EOS、Creola小体及FeNO等炎性指标的相互关系及在儿童哮喘早期预测中的确切价值有待多中心、大样本、长时间的研究和临床验证。参考文献略
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